Grazie per aver visitato nature.com.Stai utilizzando una versione del browser con supporto limitato per i CSS.Per ottenere la migliore esperienza, ti consigliamo di utilizzare un browser più aggiornato (o disattivare la modalità di compatibilità in Internet Explorer).Nel frattempo, per garantire un supporto continuo, stiamo visualizzando il sito senza stili e JavaScript.Carosello con tre diapositive mostrate alla volta.Usa i pulsanti Precedente e Successivo per navigare tra tre diapositive alla volta o i pulsanti con i puntini alla fine per saltare tre diapositive alla volta.Angela Russo, Jose A. Colina, … Joanna E. BurdetteHyesung Kim, Dong Hui Lee, … Bogun JangPui-Wah Choi, Wai Wing So, … Shu-Wing NgBasem Fares, Liron Berger, … Ruth PeretsLaura R. Hardy, Melissa R. Pergande, … Joanna E. BurdetteVictoria Cluzet, Marie M. Devillers, … Céline J. GuigonMarcia de Almeida Monteiro Melo Ferraz, Jennifer Beth Nagashima, … Nucharin SongsasenHan Deng, Eric Hillpot, … Craig D. WoodworthAnna Ruiz-Mitjana, Raúl Navaridas, … Xavier DolcetCommunications Biology volume 5, Articolo numero: 1362 (2022 ) Cita questo articoloLa maggior parte dei carcinomi sierosi ovarici di alto grado (HGSC) derivano da lesioni del carcinoma intraepiteliale tubarico sieroso (STIC) nell'estremità distale della tuba di Falloppio (FT).La formazione di lesioni STIC dalle cellule secretorie di FT porta alla semina della superficie ovarica, con successiva rapida disseminazione del tumore ad altre strutture addominali.Non è chiaro come le cellule maligne nascenti lascino il FT per colonizzare l'ovaio.Questo rapporto fornisce la prova che la molecola di adesione cellulare L1 (L1CAM) contribuisce alla capacità delle cellule secretorie FT trasformate (FTSEC) di staccarsi dal tubo, sopravvivere in condizioni indipendenti dall'ancoraggio e seminare la superficie ovarica.L1CAM era altamente espresso sulle cellule apicali delle lesioni STIC e ha contribuito alla colonizzazione ovarica sovraregolando le integrine e la fibronectina nelle cellule maligne e attivando le vie AKT ed ERK.Questi cambiamenti hanno aumentato la sopravvivenza cellulare in condizioni di attacco ultra-basso che imitano il transito dal FT all'ovaio.Per studiare la diffusione all'ovaio, abbiamo sviluppato un modello di co-coltura tumore-ovaio.Abbiamo dimostrato che l'espressione di L1CAM era importante per le cellule FT per invadere l'ovaio come gruppo coeso.I nostri risultati indicano che nelle prime fasi dello sviluppo di HGSC, i FTSEC trasformati si diffondono dal FT all'ovaio in modo dipendente da L1CAM.Il carcinoma ovarico, la neoplasia ginecologica più letale nei paesi sviluppati, è una malattia eterogenea con più sottotipi istologici che rappresenta quasi 300.000 nuovi casi e oltre 150.000 decessi in tutto il mondo ogni anno1,2,3,4.Il sottotipo più comune di carcinoma ovarico è il carcinoma sieroso di alto grado (HGSC) e la maggior parte delle pazienti con HGSC alla fine sviluppa una malattia ricorrente resistente alla chemioterapia citotossica.Gli scarsi tassi di sopravvivenza sono in parte dovuti alla mancanza di strumenti di diagnosi precoce e alla diagnosi clinica tardiva5,6.Nonostante queste terribili statistiche, negli ultimi anni sono stati compiuti progressi significativi nella nostra comprensione della patogenesi dell'HGSC.Sulla base di prove istologiche, molecolari e genetiche, è ora generalmente accettato che la maggior parte delle HGSC sorga nelle cellule secretorie della tuba di Falloppio distale (FT)7,8,9,10,11,12,13.Più recentemente, il sequenziamento di prossima generazione dei precursori delle tube di Falloppio ha mostrato che le mutazioni in TP53 sono tra i primi eventi genetici, che si verificano in cellule secretorie apparentemente benigne che non sono proliferative.Tratti di queste cellule secretorie mutate TP53 sono chiamati "firme p53" e sono considerati benigni in isolamento14,15.L'acquisizione di caratteristiche citologiche maligne e la proliferazione con espansione di queste cellule secretorie porta alla formazione di carcinomi intraepiteliali tubarici sierosi (STIC).Utilizzando il sequenziamento dell'intero esoma e la modellazione matematica, due studi indipendenti hanno recentemente dimostrato che il tempo medio tra lo sviluppo di una lesione STIC e il cancro ovarico è di circa 6,5 ​​anni9,13.Sfortunatamente, una volta che le cellule FT maligne si accampano sulla superficie dell'ovaio, la semina della cavità peritoneale sembra avvenire rapidamente da allora in poi.Questi dati suggeriscono che la capacità dei FTSEC maligni di disseminarsi e metastatizzare all'ovaio è un evento critico durante lo sviluppo di HGSC.Al momento non è noto quali eventi molecolari inducano le lesioni FT a metastatizzare all'ovaio.La molecola di adesione cellulare L1 (L1CAM) è una molecola transmembrana di tipo 1 che è sovraespressa in vari tipi di tumori umani, incluso l'HGSC e può quindi svolgere un ruolo importante nei processi neoplastici16,17.Molti studi hanno dimostrato che l'espressione di L1CAM è associata a caratteristiche maligne come chemioresistenza, transizione da epiteliale a mesenchimale (EMT), proliferazione, migrazione, invasione e sopravvivenza16.Mentre è noto che L1CAM è espresso in HGSC16,17, non è noto in quale fase dello sviluppo del cancro ovarico L1CAM sia espresso e se abbia o meno un ruolo funzionale nella trasformazione o diffusione.In questo rapporto, forniamo la prova che L1CAM svolge un ruolo fondamentale nella trasformazione e nella diffusione dei precursori HGSC FT nell'ovaio.Abbiamo scoperto che L1CAM era altamente espresso nelle cellule apicali delle lesioni STIC e che la sua espressione ha contribuito alla diffusione delle cellule.L1CAM ha promosso la formazione della sfera FTSEC e la sopravvivenza delle cellule tumorali ovariche e delle cellule FT immortalizzate.L1CAM ha mediato questo effetto attraverso l'attivazione delle vie di segnalazione dell'integrina, dell'AKT e dell'ERK che hanno aumentato la sopravvivenza cellulare in condizioni di distacco del substrato.Inoltre, l'utilizzo di un modello 3D ex-vivo di sfere FTSEC umane e ovaie di topo ha rivelato che L1CAM era importante per le cellule FT per invadere l'ovaio come gruppo coeso.I nostri risultati forniscono importanti informazioni meccanicistiche sulle prime fasi della metastasi del cancro ovarico dalla tuba di Falloppio all'ovaio.Le molecole di adesione cellulare modulano l'interazione cellulare con l'ambiente extracellulare, inclusi altri tipi cellulari e la matrice extracellulare (ECM)16.È stato dimostrato che L1CAM ha un ruolo fondamentale nella progressione metastatica in più tipi di tumore tra cui glioblastoma, melanoma, tumori mammari, renali e colorettali18,19,20,21,22.Per capire se L1CAM svolge un ruolo simile nel carcinoma ovarico, abbiamo esaminato i livelli di espressione di L1CAM in HGSC analizzando l'espressione di L1CAM RNAseq dal set di dati The Cancer Genome Atlas (TCGA).Per prima cosa abbiamo confrontato l'espressione di L1CAM in HGSC con altri tumori della coorte Pan-Cancer, un set di dati contenente oltre 10.000 diversi campioni di tumore (Fig. 1a)23.La nostra analisi ha rivelato che l'HGSC mostra alcuni dei più alti livelli di L1CAM tra i tumori solidi24.Abbiamo scoperto che l'espressione di L1CAM è correlata a una sopravvivenza globale più breve (figura 1b) e mostra un graduale aumento dalla malattia di stadio II a quella di stadio IV (figura 1c).È interessante notare che il maggiore aumento si è verificato tra lo stadio IIIA e lo stadio IIIC.Questi stadi differiscono per il grado di diffusione metastatica oltre il bacino fino alla cavità peritoneale o all'omento.Inoltre, abbiamo scoperto che l'espressione di L1CAM era significativamente più alta nei pazienti con malattia progressiva rispetto a quelli con malattia stabile (Fig. 1d).Analizzando l'espressione di L1CAM nei quattro diversi sottogruppi molecolari descritti nello studio TCGA originale (immunoreattivo, proliferativo, mesenchimale e differenziato), abbiamo trovato la più alta espressione di L1CAM nei sottogruppi mesenchimali e differenziati simili a tube di Falloppio;in particolare il sottogruppo mesenchimale mostra la prognosi peggiore (Fig. 1e)24.Nel complesso, questi dati sono coerenti con il ruolo riportato di L1CAM in altri tumori solidi e indicano che l'espressione di L1CAM è correlata alla progressione del cancro ovarico.Tuttavia, non è noto se L1CAM abbia un ruolo nello sviluppo precoce del tumore.un grafico a violino dell'espressione di L1CAM in diversi tipi di cancro dalla coorte PAN-Cancer.b Analisi della sopravvivenza globale Kaplan-Meier con il KM-Plotter di L1CAM (linea rossa) rispetto al riposo (linea nera).Il valore di cutoff di 144 è stato utilizzato con il set di sonde 204584_at.n = 1656, HR = 1,44, p = 6,1 × 10-6.c Espressione dell'mRNA L1CAM nei tumori della coorte di carcinoma ovarico TCGA in diversi stadi istologici.d, e Gli stessi campioni sono stati analizzati rispettivamente per la relazione tra l'espressione di L1CAM e la progressione della malattia e il cluster TCGA.I valori P sono stati calcolati con un test t a due code non accoppiato.* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.Recentemente abbiamo riportato che la monoubiquitylation dell'istone H2B (H2Bub1) è un segno post-traduzionale epigenetico che viene perso all'inizio durante lo sviluppo di HGSC dall'FT25.La perdita di H2Bub1 altera l'accessibilità della cromatina e attiva percorsi chiave che facilitano la progressione del cancro ovarico.Nelle cellule di mammifero, i livelli di H2Bub1 sono regolati principalmente dalla ligasi RNF20 E326.Per definire i percorsi specifici influenzati dalla perdita di H2Bub1, abbiamo utilizzato due diversi costrutti di shRNA mirati al trascritto RNF20 per abbattere l'espressione del gene RNF20 in due linee cellulari FT immortalate, FT190 e FT194.La convalida biochimica mediante l'analisi Western blot ha mostrato che l'esaurimento di RNF20 ha comportato una marcata riduzione di H2Bub1 (Fig. 2a).L'analisi dell'arricchimento di RNAseq ha rivelato che il knockdown di RNF20 e H2Bub1 ha provocato l'up-regulation di sette percorsi cellulari comuni (Fig. 2b, Dati supplementari 1, 2).I sette percorsi sono stati arricchiti in processi correlati alla motilità cellulare, alla matrice extracellulare e all'adesione cellulare (Fig. 2c, Dati supplementari 2).Comune ai tre percorsi correlati all'adesione cellulare era L1CAM.In effetti, l'analisi dell'array di proteine ​​​​in fase inversa (RPPA) ha rivelato che L1CAM era tra le proteine ​​​​più significativamente sovraregolate dopo il knockdown di RNF20 e H2Bub1 (Fig. 2d).L'analisi Western blot ha mostrato che l'esaurimento di RNF20 ha comportato un marcato aumento di L1CAM in entrambe le linee cellulari (Fig. 2e).Dati i tempi iniziali della perdita di H2Bub1 e la connessione tra H2Bub1, RNF20 e L1CAM, abbiamo ipotizzato che l'induzione di L1CAM si verifichi nelle prime lesioni precursori di FT.un'analisi Western blot di RNF20, H2Bub1 e H2B in FT190 e FT194 trattati con due shRNA mirati a RNF20 o uno shRNA di controllo.b Diagramma di Venn dei 25 percorsi più arricchiti nelle cellule FT190 e FT194 che sono state trattate con due shRNA (sh890 o sh692) per abbattere la ligasi RNF20 E3.c Visualizzazione dei 7 percorsi che si sovrappongono a tutte le condizioni in A. I grafici a barre rappresentano il valore p aggiustato del False Discovery Rate (FDR) nella scala -log10.Il colore rappresenta la percentuale di geni regolati in ciascun percorso.d Grafico vulcanico di cellule FT190 trattate con shRNA RNF20 e analizzate con RPPA.I punti rossi rappresentano le proteine ​​che sono significativamente regolate.I punti arancioni rappresentano i campioni che sono regolati su 0,5 log2 volte (1,4 volte) e il verde rappresenta le proteine ​​che sono regolate in modo significativo e 0,5 log2 volte.e Analisi Western blot di L1CAM e beta actina in FT190 e FT194 trattati con due shRNA mirati a RNF20 o uno shRNA di controllo.Per testare la previsione che L1CAM è espresso nello sviluppo iniziale di HGSC, abbiamo analizzato l'espressione della proteina L1CAM mediante immunoistochimica (IHC) nelle lesioni precursori di FT.IHC per p53, p16 e stathmin è stato utilizzato per accreditare diciassette casi di campioni di FT con lesioni STIC come precedentemente descritto25,27,28.Usando un anticorpo specifico L1CAM29,30, abbiamo scoperto che l'espressione L1CAM era prontamente rilevabile in 16 delle 17 lesioni STIC (Fig. 3a, b).È interessante notare che l'espressione di L1CAM era presente nei precursori p53 negativi (Fig. 3a) e p53 positivi (Fig. 3b).Non abbiamo osservato un'espressione omogenea di L1CAM in tutte le lesioni STIC, ma piuttosto un gradiente con espressione di picco vicino alle regioni apicali delle lesioni STIC (Fig. 3a-c).Alcune delle cellule che si sono colorate maggiormente per L1CAM sembravano anche essere staccate dalla lesione STIC principale, suggerendo che L1CAM è arricchito nella disseminazione delle lesioni STIC31.A sostegno di questa ipotesi, in una sezione abbiamo trovato ammassi cellulari positivi per p53 e L1CAM che sono stati staccati dalla lesione originale e rilevati in una regione adiacente del normale epitelio di Falloppio (Fig. 3d).In 10 sezioni epiteliali FT benigne, abbiamo osservato solo rare cellule positive a L1CAM (Fig. 3d, e).Insieme, questi dati ci hanno motivato a indagare ulteriormente sul contributo di L1CAM ai fenotipi associati alla diffusione precoce di HGSC dal FT.a lesione STIC p53-negativa e b lesione STIC p53-positiva.Entrambi sono stati colorati per L1CAM, Stathmin, p16 e p53.c Lesione STIC macchiata per L1CAM e p53.d Tessuto normale della tuba di Falloppio con cellule metastatiche p53-positive che galleggiano nel lume tubarico colorato per L1CAM e p53.e Tessuto normale delle tube di Falloppio colorato per L1CAM.Per iniziare a decifrare il ruolo di L1CAM in HGSC, abbiamo analizzato l'espressione di L1CAM in un pannello di linee cellulari di carcinoma ovarico mediante Western blot e abbiamo scoperto che tutte le linee cellulari esprimevano la proteina L1CAM rilevabile (Fig. 4a).Allo stesso modo, nelle cellule primarie derivate dal liquido di ascite dei pazienti con HGSC, abbiamo trovato un'elevata espressione di L1CAM in sette dei nove campioni (Fig. 4b) 32.In FTSEC primari derivati ​​da donatori sani e immortalati utilizzando diverse tecniche27,33,34, abbiamo scoperto che alcune linee cellulari mostravano poca o nessuna espressione (FT33, FT33-RAS, FT65, FT190, FT237, FT240, FT246), alcune mostravano espressione moderata (FT189, FT194 e FT282) e uno ha mostrato alta espressione (FT282CE) di L1CAM (Fig. 4c).Quest'ultima linea cellulare è stata ingegnerizzata per sovraesprimere la ciclina E1 ed è parzialmente trasformata34.Confrontando direttamente i FTSEC immortalizzati con le linee cellulari del cancro ovarico, abbiamo scoperto che L1CAM era più altamente espresso nelle linee cellulari del cancro (Fig. 4d).Mentre l'immunofluorescenza per L1CAM membranosa legata alla superficie era ampiamente correlata con i nostri dati Western blot, ha anche mostrato che all'interno delle singole linee cellulari, le cellule esprimono un ampio spettro di L1CAM (Fig. 4e).L'eterogeneità dell'espressione di L1CAM all'interno delle linee cellulari, che è stata osservata anche mediante citometria a flusso utilizzando la colorazione superficiale di L1CAM, riflette la nostra osservazione nelle lesioni STIC (Figura 1a supplementare).Analisi Western blot dell'espressione di L1CAM nelle linee cellulari di carcinoma ovarico ( a ) cellule HGSC derivate dall'ascite primaria ( b ) e linee cellulari immortalizzate della tuba di Falloppio ( c ) e un pannello che confronta le linee cellulari immortalizzate della tuba di Falloppio con le linee cellulari del carcinoma ovarico ( d ).L'actina è stata utilizzata come controllo del caricamento.L'espressione relativa di L1CAM è stata calcolata dal rapporto tra la densitometria di L1CAM divisa per l'actina.e Immagini di immunofluorescenza di linee cellulari selezionate per la superficie L1CAM (verde) e DAPI (blu) per colorare il nucleo.f Migrazione relativa in OVCAR8, CAOV3 e FT282-CE dopo abbattimento di siRNA di L1CAM o trattamento con siRNA di controllo.g Migrazione relativa in FT33-RAS, FT189, FT237 e FT246, misurata dopo la sovraespressione di L1CAM o un vettore di controllo vuoto.e La barra della scala rappresenta 100 µm.f, g Sono stati eseguiti tre esperimenti indipendenti e i valori P sono stati calcolati con un test t a due code non accoppiato.* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.Per esaminare se L1CAM contribuisce ai fenotipi associati alla disseminazione e alla metastasi del tumore, abbiamo utilizzato l'interferenza dell'RNA per valutare l'impatto del knockdown L1CAM sulla migrazione delle cellule OVCAR8, CAOV3 e FT282CE (Figura 1b supplementare).Abbiamo osservato una significativa riduzione della migrazione in tutte e tre le linee dopo il knockdown di L1CAM (Fig. 4f).Al contrario, quando abbiamo sovraespresso L1CAM nelle linee cellulari delle tube di Falloppio con espressione bassa o moderata di L1CAM (Figura 1c supplementare), abbiamo riscontrato un aumento significativo della migrazione cellulare (Figura 4g).Questi dati supportano l'ipotesi che L1CAM sia funzionalmente coinvolto nella regolazione della diffusione del cancro ovarico dalla tuba di Falloppio.Un altro importante segno distintivo della progressione del cancro ovarico è la capacità delle cellule tumorali di staccarsi dal sito primario e di passare a strutture multicellulari fluttuanti libere che sono supportate dall'adesione cellula-cellula e cellula-matrice35.Poiché L1CAM è una molecola di adesione cellulare, abbiamo esaminato il contributo di L1CAM alla formazione e al mantenimento di strutture multicellulari utilizzando la linea cellulare di carcinoma ovarico OVCAR8.Abbiamo scelto le cellule OVCAR8 perché formano spontaneamente cluster multicellulari tridimensionali quando coltivate in condizioni aderenti.Abbiamo anche osservato mediante citometria a flusso e immunofluorescenza che L1CAM è espresso in modo eterogeneo all'interno di più linee cellulari tra cui OVCAR8 (Fig. 4e, Fig. 1a supplementare).Usando perline magnetiche accoppiate a un anticorpo L1CAM siamo stati in grado di selezionare e isolare negativamente cellule OVCAR8 isogeniche che esprimono livelli di proteina L1CAM non rilevabili (Fig. 5a).Le cellule sono rimaste negative per L1CAM su più passaggi (fino a 10 passaggi).Le cellule OVCAR8 L1CAM-low (definite OVCAR8-L1low) erano significativamente ridotte nella loro capacità di formare cluster multicellulari compatti in condizioni di coltura aderenti (Fig. 5b, Fig. 2a supplementare) e in condizioni di adesione ultra-bassa (ULA) (Fig. .5c).La ridotta capacità di formare sfere in condizioni 3D era più pronunciata dopo 1 e 2 giorni, ma era meno drammatica dopo sei giorni di coltura (Fig. 5c, Fig. 2b supplementare), indicando un ruolo importante per L1CAM nell'inizio della formazione della sfera .Inoltre, abbiamo scoperto che la perdita di L1CAM riduceva fortemente la formazione di colonie, la compattazione e ostacolava la capacità delle cellule di invadere (Fig. 5d-f, rispettivamente).Per confermare i nostri risultati, abbiamo utilizzato CRISPR/Cas9 per eliminare L1CAM in OVCAR8 (Figura 2c, d supplementare).Simile alle cellule OVCAR8 L1CAM-low, abbiamo osservato una ridotta capacità di formare aggregati multicellulari in più cloni knockout L1CAM (Figura 2e supplementare).un'analisi Western blot dell'espressione di L1CAM in cellule OVCAR8 e isogeniche OVCAR8-L1low (passaggio 10).b Immagini a contrasto di fase che rappresentano cellule OVCAR8 e OVCAR8-L1low cresciute per 6 giorni in condizioni 2D.c Immagini a contrasto di fase che rappresentano cellule OVCAR8 e OVCAR8-L1low cresciute per 1, 2 e 6 giorni cresciute in condizioni 3D e per 6 giorni.d Il saggio di formazione della colonia è stato quantificato per la dimensione della colonia in diverse popolazioni di cellule OVCAR8 e Le cellule sono state misurate per la compattazione (variazione dell'area).f Invasione relativa delle cellule OVCAR8 e OVCAR8-L1low.g Cellule OVCAR8 e OVCAR8-L1low analizzate mediante microscopia in campo chiaro (riga inferiore) e per colonie 3D con cristalvioletto (riga superiore) dopo la coltura in condizioni 3D in terreni privi di siero.(h, pannello di sinistra) Immagini fluorescenti che rappresentano OVCAR8 e OVCAR8-L1low colorate per calceina (verde) e bromuro di etidio (rosso).(g, pannello di destra) Grafico a punti che mostra il rapporto tra cellule vive e morte, valutato misurando il rapporto tra intensità di calceina (verde) e bromuro di etidio (rosso) nelle cellule OVCAR8 e OVCAR8-L1low dopo coltura per 7 giorni in 3D e siero condizioni libere.i, j Esperimento di salvataggio: riespressione di L1CAM analizzata mediante Western blot (i) in OVCAR8-L1low e il suo effetto sulla formazione della sfera.j Grafico a punti che rappresenta il numero di colonie dopo che le cellule sono state trasferite dalla coltura cellulare 3D a 2D.k Effetti del trattamento con anticorpi L1CAM (anti-L1-9.3) sulla dimensione della sfera dopo 48 ore.b, c, g, h, j La barra della scala rappresenta 200 µm.Sono stati eseguiti tre esperimenti indipendenti (d, e, f, j).I valori P sono stati calcolati con un test t a due code non accoppiato.* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.k Per calcolare la significatività sono stati utilizzati i test di confronto multiplo ANOVA e Dunnett.È importante sottolineare che, quando cresciuto in condizioni prive di siero, la capacità di formare sfere è stata completamente abrogata nelle cellule OVCAR8-L1low (Fig. 5g) portando ad un aumento della morte cellulare misurata dall'assorbimento di bromuro di etidio in quelle colture (Fig. 5h) .La riespressione ectopica di L1CAM in OVCAR8-L1low ha parzialmente salvato la formazione di aggregati (Fig. 5i, j), mentre l'applicazione di un anticorpo inibitorio che blocca le interazioni L1CAM omofile (clone L1-9.3) ha ridotto significativamente la dimensione dei cluster multicellulari (Fig. 5k)29.Presi insieme, questi risultati indicano che l'espressione di L1CAM nelle cellule tumorali ovariche promuove l'adesione cellula-cellula che supporta la formazione di cluster multicellulari.Per esaminare se L1CAM è sufficiente per promuovere cluster multicellulari, abbiamo sovraespresso ectopicamente L1CAM o un controllo vettoriale vuoto nelle linee cellulari FTSEC FT237, FT240, FT246 e FT282 (Fig. 6a).Quando i FTSEC che esprimono L1CAM sono stati coltivati ​​come monostrato o in condizioni ULA, sembravano formare cluster multicellulari (Fig. 6b, c e Fig. 3a supplementare).Al contrario, le cellule di controllo mantenevano un monostrato o generavano cluster multicellulari vagamente attaccati (Fig. 6b, c e Fig. 3a supplementare).Questi dati indicano che L1CAM attraverso il suo dominio extracellulare media l'adesione cellula-cellula che porta alla formazione di cluster multicellulari.L'aumento della formazione della struttura multicellulare ha portato a una riduzione della morte cellulare e ad un aumento del numero di cellule viventi quando FT237 e FT240 sono stati coltivati ​​in condizioni ULA e prive di siero (Fig. 6d e Fig. 3b, c, rispettivamente).Abbiamo osservato risultati simili quando due linee FT aggiuntive sovraesprimono L1CAM rispetto al controllo vettoriale vuoto (Figura 3d supplementare).Per rispondere alla domanda se il dominio extracellulare di L1CAM abbia contribuito alla formazione di cluster cellulari, abbiamo nuovamente applicato l'anticorpo specifico per L1CAM (L1-9.3) che inibisce il legame omofilo29,36.Quando coltivato in presenza dell'anticorpo, la dimensione della sfera era significativamente ridotta rispetto al controllo IgG (Fig. 6e)36.È interessante notare che l'effetto dell'anticorpo è stato più pronunciato durante la fase iniziale dell'aggregazione dei cluster, suggerendo un coinvolgimento precoce di L1CAM nella mediazione dell'adesione cellula-cellula.Presi insieme, questi dati indicano che l'espressione di L1CAM in FTSEC è sufficiente per evocare l'aggregazione multicellulare e promuovere la sopravvivenza indipendente dall'ancoraggio, i fenotipi associati alla disseminazione precoce delle cellule tumorali dalla tuba di Falloppio.un'analisi Western blot di linee cellulari primarie di tube di Falloppio trasfettate con L1CAM o un vettore di controllo e analizzate per l'espressione di L1CAM e GAPDH (gene housekeeping).b Immagini in campo chiaro di linee cellulari primarie delle tube di Falloppio da a.La barra della scala rappresenta 200 µm.c Quantificazione dell'area in µm2 delle sfere mostrate in b.d (pannello di destra) Immagini fluorescenti che rappresentano cellule FT237 trasfettate con un L1CAM o (pannello di sinistra) un vettore di controllo.Grafico a punti raffigurante il rapporto tra cellule vive e morte, valutato misurando il rapporto tra intensità di calceina (verde) e bromuro di etidio (rosso) nelle cellule FT237 trasfettate con L1CAM o un vettore di controllo dopo la coltura in condizioni 3D e senza siero.La barra della scala rappresenta 100 µm.(e, pannello di sinistra) Grafico a punti che mostra la dimensione della sfera delle cellule FT237 che è stata analizzata dopo la trasfezione con vettore di controllo o L1CAM con l'aggiunta dell'anticorpo IgG o dell'anticorpo anti L1-9.3.(e, pannello di destra) Immagini fluorescenti (calceina, verde) che rappresentano le cellule FT237 trasfettate con il vettore di controllo (a sinistra) o L1CAM con l'aggiunta dell'anticorpo IgG o dell'anticorpo anti L1-9.3.La barra della scala rappresenta 250 µm.Sono stati eseguiti tre esperimenti indipendenti (c, d).I valori P sono stati calcolati con un test t a due code non accoppiato.* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.Per calcolare la significatività sono stati utilizzati i test di confronto multiplo ANOVA e Dunnett.L'osservazione che l'espressione di L1CAM porta alla formazione di aggregati multicellulari, definiti da una robusta compattazione e adesione cellulare, ci ha portato a ipotizzare che, a causa del legame omofilo di L1CAM, le cellule che esprimono alti livelli di L1CAM potrebbero interagire preferenzialmente con altre cellule che esprimono L1CAM.Per verificare questa ipotesi, abbiamo sovraespresso L1CAM in due diverse linee cellulari delle tube di Falloppio e co-coltivate queste cellule con un rapporto di 1:10 con cellule di controllo non trasdotte in condizioni ULA.Per visualizzare le co-colture, abbiamo etichettato le cellule FT che sovraesprimono L1CAM in rosso e le cellule di controllo in verde con coloranti fluorescenti.È interessante notare che, simile all'espressione nelle lesioni STIC, le cellule che sovraesprimono L1CAM si raggruppano insieme all'interno della sfera FT (Figura 4a supplementare).Quando abbiamo co-coltivato OVCAR8 con normali linee cellulari delle tube di Falloppio con un rapporto di 1:10, le cellule OVCAR8 si sono raggruppate e attaccate come gruppi di cellule ai cluster delle tube di Falloppio, ma non si sono intervallate nelle cellule delle tube di Falloppio (Figura complementare 4b) .Tuttavia, durante la co-coltura delle cellule OVCAR8-L1low con le cellule delle tube di Falloppio, abbiamo osservato una più forte mescolanza di entrambi i tipi di cellule (Figura 4b supplementare).Questi dati indicano che le cellule che esprimono L1CAM si legano ad altre cellule che esprimono L1CAM preferenzialmente attraverso il legame omofilo e meno alle cellule prive di L1CAM.Per esaminare i meccanismi dipendenti da L1CAM associati alla formazione di aggregati multicellulari, abbiamo eseguito l'analisi RPPA (Figura 5 supplementare) di cellule di controllo OVCAR8 e OVCAR8-L1low coltivate come monostrati (2D) o cluster multicellulari (3D).Uno dei cambiamenti più drammatici che abbiamo notato è stata la perdita quasi completa dell'espressione della fibronectina nelle cellule L1CAM-negative cresciute in condizioni 2D e 3D (Fig. 7a, Fig. 5a supplementare).Abbiamo quindi analizzato l'espressione della proteina fibronectina (Fig. 7b: dati RPPA, asse Y) nel set di dati TCGA del cancro ovarico.Abbiamo diviso i casi in tre gruppi in base alla loro espressione di mRNA L1CAM (asse X) (alta, media e bassa; determinata rispetto all'espressione mediana) e abbiamo scoperto che i tumori che esprimono alti livelli di L1CAM esprimevano anche significativamente più proteina fibronectina (asse Y ) (figura 7b).Per analizzare la co-espressione di L1CAM e fibronectina in condizioni di coltura 3D e 2D, abbiamo riseminato le sfere durante la notte su un coprioggetto e analizzato le sfere attaccate mediante immunofluorescenza per fibronectina e L1CAM.È interessante notare che abbiamo scoperto che L1CAM e la fibronectina hanno mostrato la più alta co-espressione nella parte non attaccata della sfera, mentre le cellule che si attaccavano alla superficie plastica crescevano in un monostrato e mostravano un'espressione molto più bassa (Fig. 7c).un'analisi Western blot di fibronectina, Integrina ɑ5, Integrina β1, Integrina β3, L1CAM e GAPDH in OVCAR8 e OVCAR8-L1low in condizioni di coltura 2D e 3D.Viene mostrato l'esperimento rappresentativo (n = 5).b Grafico a punti che rappresenta l'espressione della proteina RPPA della fibronectina nei tumori del cancro ovarico della coorte TCGA con un'espressione di mRNA L1CAM alta, media e bassa.c Immagini fluorescenti che rappresentano L1CAM (rosso) e fibronectina (verde) nelle cellule OVCAR8 coltivate in condizioni 3D prima della risemina sui vetrini coprioggetto per la fissazione.La barra della scala rappresenta 200 µm.d mRNA fold change of Integrin alpha 5 (sinistra) e Fibronectina (destra) misurato mediante PCR quantitativa in tempo reale nelle cellule OVCAR8 e OVCAR8-L1low.e Analisi Western blot di FT237, FT240 e FT246 trasfettate con L1CAM o un vettore di controllo.Viene mostrato il Western blot rappresentativo (n = 3).f Grafico a dispersione che rappresenta l'array di protein chinasi in FT237 e FT246 che esprimono plasmide di controllo e L1CAM contenente plasmide.g Analisi Western blot di FT237 e OVCAR8 analizzata 72 ore dopo il trattamento con siRNA, mirata alla fibronectina, Integrina ɑ5.Viene mostrato il Western blot rappresentativo (n = 3) (h) Box plot che rappresenta la quantificazione della dimensione della sfera di FT237-ctrl e FT237 + L1CAM dopo il knockdown siRNA di fibronectina o Integrina ɑ5.Sono stati eseguiti tre esperimenti indipendenti (b, c).I valori P sono stati calcolati con un test t a due code non accoppiato.* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.h Per calcolare la significatività sono stati utilizzati i test di confronto multiplo ANOVA e Dunnett.Precedenti studi hanno documentato i ruoli importanti della fibronectina e dell'integrina-ɑ5β1 nella creazione del supporto della matrice extracellulare per le cellule tumorali ovariche37,38.Coerentemente con queste funzioni, abbiamo osservato una forte sottoregolazione dell'integrina ɑ5β1 (costituita da subunità ɑ5 e β1) nelle cellule OVCAR8-L1low rispetto alle cellule OVCAR8 di controllo (Fig. 7a).Successivamente abbiamo misurato l'espressione dell'mRNA di fibronectina e integrina-ɑ5 nel controllo OVCAR8 e OVCAR8-L1low (Fig. 7d).Abbiamo osservato che la perdita di L1CAM nelle cellule OVCAR8 ha portato a una significativa riduzione dei livelli di espressione di fibronectina e integrina-ɑ5 mRNA (Fig. 7d).Inoltre, l'analisi della coorte Pan-Cancer del database TCGA ha confermato una significativa correlazione positiva dell'espressione di L1CAM con l'espressione di fibronectina e integrina-ɑ5 (rispettivamente 17 su 33 e 19 su 33 tipi di cancro) nella maggior parte dei tipi di cancro, tra cui carcinoma ovarico (Figura 6a, b supplementare).Sulla base di questi risultati, abbiamo successivamente analizzato se la sovraespressione di L1CAM nelle linee cellulari FT primarie regola anche l'espressione di fibronectina e integrina-ɑ5β1 (Fig. 7e).Mentre tutte le linee cellulari FT esprimevano già alti livelli di fibronectina, la sovraespressione di L1CAM ha causato un ulteriore aumento dell'espressione di fibronectina, in particolare in FT237.Inoltre, abbiamo osservato una maggiore espressione della subunità integrina-ɑ5 in tutte le linee cellulari che sovraesprimono L1CAM.Presi insieme questi dati supportano l'ipotesi che L1CAM attraverso la regolazione dell'integrina e l'espressione della matrice promuova la formazione di strutture multicellulari e la sopravvivenza delle cellule neoplastiche.I nostri dati indicano che L1CAM è richiesto per l'espressione dell'integrina ɑ5β1 e della fibronectina;molecole di adesione cellulare che sono state implicate nella sopravvivenza e nella diffusione delle cellule del cancro ovarico18,20,22,39,40,41.Inoltre, è stato riportato che l'espressione di L1CAM attiva le vie della proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK) in diversi modelli di linee cellulari.Pertanto, abbiamo ipotizzato che L1CAM sia coinvolto nella regolazione delle vie di segnalazione pro-sopravvivenza nelle linee cellulari FTSEC e tumorali.Per testare la nostra ipotesi, abbiamo analizzato un array di segnalazione MAPK e AKT dopo la sovraespressione di L1CAM in due linee cellulari FT immortalate.Abbiamo trovato una forte attivazione di ERK e AKT nelle cellule che esprimono L1CAM rispetto ai controlli (Fig. 7e, f, Fig. 7a supplementare).Di conseguenza, abbiamo osservato una ridotta attività in entrambi i percorsi nelle cellule OVCAR8-L1low (Figura 7b supplementare), che è anche in accordo con i rapporti precedenti, sebbene i nostri risultati non abbiano raggiunto la significatività statistica42,43,44.Inoltre, l'attenuazione mediata da siRNA dell'espressione di fibronectina o integrina-ɑ5 ha abrogato l'attivazione di ERK e AKT nelle linee cellulari delle tube di Falloppio, mentre ha ridotto l'attivazione di AKT ma non di ERK nelle cellule OVCAR8 (Fig. 7g, Figura 7c – e supplementare) .È importante sottolineare che il knockdown della fibronectina o dell'integrina-ɑ5 ha anche ridotto la capacità delle cellule OVCAR8 e FT237 di formare aggregati cellulari (Fig. 7h, Figura 7c-e supplementare), suggerendo che l'adesione cellula-matrice-cellula mediata dall'integrina α5 supporta il tumore sopravvivenza cellulare.Questi risultati sono coerenti con il ruolo delle integrine e dell'ECM nel sostenere la diffusione del cancro ovarico.I nostri risultati supportano l'ipotesi che L1CAM promuova la migrazione cellulare con la formazione e la sopravvivenza di aggregati multicellulari, due fenotipi associati alla diffusione precoce del cancro ovarico dalla tuba di Falloppio alle ovaie.L1CAM media queste attività attraverso la stabilizzazione di complessi integrina-matrice che attivano percorsi pro-sopravvivenza tra cui AKT ed ERK.vol.Fr.Esp.Esp.